top of page

Сравнительное исследование Allergy Explorer (ALEX) и платформы ImmunoCAP.

Charlotte Nerelius*, Malin Berthold#

 

*Research and Development, Thermo Fisher Scientific, Uppsala, Sweden, #Scientifc and Medical Affairs, Thermo Fisher Scientific, Uppsala, Sweden

История вопроса

Чип ALEX® – многокомпонентный тест, позволяющий одновременное измерение общего IgE (tlgE) и специфических lgE (sIgE) к экстрактам аллергенов и аллергокомпонентам в одном исследовании. В общей сложности, измеряется 282 аналита, 156 экстрактов и 125 компонентов, а также общий IgE.

 

При сравнении с ImmunoCAPTM ISAC 112, 81 аллергокомпонент перекрывается, 44 уникальны для теста ALEX, в то время, как 31 присутствуют только в тесте ImmunoCAP ISAC.

 

Производитель теста ALEX утверждает, что тест предоставляет полуколичественные результаты для tIgE до 2500 kU/L, для sIgE к экстрактам аллергенов и аллергокомпонентам указываются количественные результаты в диапазоне до 50 kUA /L.1

Все однокомпонентные тесты ImmunoCAP для общего IgE, экстрактов аллергенов и аллергокомпонентов выдают количественные результаты, соотносящиеся со стандартом ВОЗ.2,3

 

Многокомпонентный тест ImmunoCAP ISAC содержит 112 аллергокомпонентов и генерирует полуколичественные результаты (стандартизированные единицы ISAC/ISU).4

Цель

Целью была оценка технической производительности теста ALEX в измерении общего IgE, sIgE к полным экстрактам аллергенов и аллергокомпонентов в сравнении с результатами однокомпонентных тестов ImmunoCAP (общий IgE, sIgE) и многокомпонентной платформы ImmunoCAP ISAC sIgE 112

Дизайн эксперимента и методы

Основываясь на доказанной клинической важности и представленности в обеих платформах ALEX и ImmunoCAP, для исследования были одиннадцать полных аллергенов и соответствующих аллергокомпонентов, представляющих разные группы аллергенов (сезонные/круглогодичные ингаляционные аллергены, пищевые аллергены животного и растительного происхождения).

​

Образцы, полученные из Отдела диагностических образцов Phadia AB, отбирались на основе известного положительного sIgE-ответа на отобранные полные аллергены и соответствующие компоненты, присутствующие в микрочипе. Для исследования были взяты образцы с положительным ответом на несколько экстрактов и уровнем sIgE в диапазоне от 0.35 до 50 kUA /L.

​

В общей сложности было проанализировано 64-66 образцов сыворотки с помощью теста ALEX, тестов ImmunoCAP для определения специфического IgE к полным аллергенам, теста ImmunoCAP для определения общего IgE и теста для определения sIgE к 112 аллергокомпонентам на чипе ImmunoCAP ISAC. 19-50 образцов также исследовали с помощью тестов ImmunoCAP для определения специфического IgE к аллергокомпонентам (n=25), представляющих выбранные полные аллергены (Табл. 1).

​

Все исследования были проведены согласно инструкциям каждого производителя профессиональными лабораторными работниками. Тесты ALEX проводились в Сервисной лаборатории Thermo Fisher Scientific, Аллерёд, Дания, все остальные тесты – в R&D отделе в Упсале, Швеция.

Статистический анализ

Согласованность между разными тест-системами оценивалась на образцах, для которых были получены не менее шести положительных результатов как в тестах ALEX, так и в ImmunoCAP. Для сравнения методов использовалась процедура сравнения Пассинга-Баблока5 с применением последующего линейного регрессионного анализа. Анализ проводился отдельно для каждого аллергена в диапазоне измерений, соответствующего тесту ALEX (0.3-50 kUA /L для sIgE; 1-2500 kU/l для общего IgE), согласно инструкции производителя. Рассчитывалась общая положительная и отрицательная согласованность, а также согласованность в пределах классов на основе классов, определённых для теста ALEX.

2019-09-11_16-00-51.png

РЕЗУЛЬТАТЫ

Общий IgE

2019-09-11_16-05-04.png

Результаты общего IgE в тесте ImmunoCAP для образцов сыворотки (n=65) находились в диапазоне между 7 и 7900 kU/L, в то время, как результаты теста ALEX укладывались в диапазон между 12 и 654 kU/L. Корреляция между тестами ALEX и ImmunoCAP выше 500kU/L была слабой (Рис. 1). Согласно информации производителя, измерительный диапазон теста ALEX – 1-2500 kU/L, результаты полуколичественные.1 Тест ImmunoCAP на общий IgE выдаёт количественные результаты.2

Рисунок 1. Корреляция между результатами общего IgE для тестов ALEX и ImmunoCAP, демонстрирующая точечные данные в диапазоне до 2500 kU/L (n=58) для ImmunoCAP. Семь точек для результатов свыше 2500 kU/L, полученных на ImmunoCAP, не включены в анализ. Регрессионная кривая отмечена красным.

Экстракты аллергенов: ALEX и Полные Аллергены ImmunoCAP

Согласованность по классам

Согласно информации производителей, как тест ALEX, так и тесты ImmunoCAP для специфического IgE генерируют количественные результаты.1,3 Тем не менее, для более легкого сравнения результатов во всём диапазоне измерений результаты для экстрактов аллергенов были трансформированы в классы, которые указаны для ALEX (Табл. 2) и согласованность данных теста ALEX с данными тестов ImmunoCAP рассчитывалась для класса. Корреляции для всех результатов приведены на Рисунке 2.

2019-09-11_16-31-00.png

Таблица 2. Абсолютная согласованность результатов теста ALEX и результатов теста ImmunoCAP в рамках классов, указанных для ALEX. Обзая согласованность классов составила 53% (вверху). Тепловая карта результатов теста ALEX и результатов теста ImmunoCAP (внизу). Частота ложноотрицательных результатов, определенная как <0.3 kUA/L в тесте ALEX и как ≥0.3 kUA/L в тестах ImmunoCAP, была на уровне 55% (234/423 положительных результатов ImmunoCAP) для теста ALEX. Ложноотрицательные результаты обнаруживались во всём измерительном диапазоне.

2019-09-11_16-40-35.png

Мы также проанализировали количественные корреляции результатов отдельных тестов с экстрактами аллергенов. На Рисунке 3 показано два примера каждого экстракта аллергенов с хорошей или плохой согласованностью, соответственно, при сравнении результатов теста ALEX с результатами тестов ImmunoCAP на специфический IgE для полных аллергенов. Результаты тестов ImmunoCAP были оценены как положительные, поскольку превышали порог для теста ALEX, т. е., ≥0.3 kUA /L. Важно отметить, что количество положительных результатов для тестов ImmunoCAP могло быть выше в случае включения результатов в диапазоне до 0.1 kUA /L (отражая LoQ для тестов ImmunoCAP на специфический IgE).

Количественные сравнения

Рисунок 2. Корреляция результатов всех тестов ALEX и ImmunoCAP на специфический IgE для полных аллергенов (n=709 точечных данных). Образцы с уровнем до 203 kUA /L sIgE, согласно результатам теста ImmunoCAP sIgE, генерировали результаты до 36 kUA /L в тесте ALEX. Затенённая область показана в увеличении на нижнем графике.

2019-09-11_16-45-03.png
2019-09-11_16-46-28.png

Рисунок 3a. Корреляция результатов тестов ALEX и ImmunoCAP на специфический IgE в kUA /L для D. pteronyssinus (вверху) и тимофеевки (внизу). Полный набор данных изображен в виде логарифмической диаграммы разброса данных (рисунки слева). Корреляции точечных данных, положительные для обеих систем и в рамках измерительного диапазона теста ALEX 0,3-50 kUA /L, показаны справа (регрессионная кривая красного цвета). 39 образцов D. pteronyssinus (клещ домашней пыли, d1) и 47 образцов тимофеевки из общего количества в 65 образцов были положительны в тестах ImmunoCAP на специфический IgE (≥0.3 kUA /L). В тесте ALEX количество положительных образцов было 31 и 25, соответственно.

2019-09-11_17-18-22.png

Рисунок 3b. Корреляция результатов тестов ALEX и ImmunoCAP на специфический IgE для полных аллергенов в kUA /L для экстрактов лесного ореха (вверху) и пыльцы оливы (внизу). Полный набор данных изображен в виде логарифмической диаграммы разброса данных (рисунки слева). Корреляции точечных данных, положительные для обеих систем и в рамках измерительного диапазона теста ALEX 0,3-50 kUA /L, показаны справа (регрессионная кривая красного цвета). 42 образца для лесного ореха и 41 образец для оливы из общего количества в 64 образца были положительными в тестах ImmunoCAP на специфический IgE (≥0.3 kUA /L). Для результатов теста ALEX те же экстракты дали 17 и 13 положительных ответов, соответственно.

  • Чувствительность теста ALEX для полных аллергенов находится на низком уровне: 55% (234/423) ложноотрицательных результатов получены с помощью теста ALEX по сравнению с тестами ImmunoCAP на специфический IgE.

​

​

  • Тест ALEX имеет низкий динамический диапазон: ни один из результатов не превысил значения 36 kUA/L (n=423 положительных точечных данных) для образцов с уровнем ≥100 kUA/L в тестах ImmunoCAP на специфический IgE.

Выводы:

  • Низкая согласованность классов с тестами ImmunoCAP, где тест ALEX продемонстрировал более низкие результаты во всём динамическом диапазоне. Общая согласованность классов была на уровне 53%, колеблясь в промежутке 4 – 40% для положительных классов.

​

  • Согласованность положительных количественных результатов варьировалась от 23% до 80% для исследованных 11 экстрактов.

​

  • Тест ALEX не имеет очевидных проблем с фоном: ALEX и тесты ImmunoCAP на специфический IgE показали согласованность на уровне 99,7% для отрицательных результатов.

Компоненты аллергенов: ALEX и Аллергокомпоненты ImmunoCAP

Общую согласованность результатов по уровню sIgE на компоненты аллергенов в тесте ALEX и тестах ImmunoCAP анализировали путём перевода результатов в «классы ALEX». Был проведён анализ двадцати пяти компонентов из 11 выбранных экстрактов аллергенов с использованием 19-50 образцов сыворотки на каждый компонент (Табл. 1). Согласованность между данными теста ALEX и данными теста ImmunoCAP рассчитывалась в рамках каждого класса (Табл. 3).

Таблица 3. Согласованность результатов компонентов в тесте ALEX и тестах на аллергокомпоненты ImmunoCAP в «классах ALEX». Общая согласованность классов составила 70 % (вверху). Тепловая карта результатов теста ALEX и тестов ImmunoCAP приведена внизу. Уровень ложноотрицательных результатов ответа IgE на компоненты (определён как <0.3 kUA /L в тесте ALEX, но ≥0.3 kUA /L в тестах ImmunoCAP) составил 33% (140/426) для теста ALEX. Ложноотрицательные результаты встречались во всём диапазоне измерений.

2019-09-11_17-15-01.png

Поскольку производитель теста ALEX указывает, что тест выдаёт количественные результаты1 , также были посчитаны корреляции между результатами в kUA /L в тестах ALEX и ImmunoCAP на специфический IgE для отдельных компонентов аллергенов. Для четырёх компонентов, а именно Cor a 14 и Cor a 1 лесного ореха, Par j 2 постенницы и Phl p 7 тимофеевки, провести регрессионный анализ не представлялось возможным из-за слишком малого количества положительных ответов в тесте ALEX (менее шести положительных сывороток). Для Cor a 1 и Phl p 7 количество положительных сывороток для двух систем оказалось слишком незначительным для любых значимых выводов, в то время, как для Par j 2 и Cor a 14 23 из 41 образца и 13 из 40 образцов, соответственно, были положительными в тестах ImmunoCAP (≥0.3 kUA /L). Соответствующее количество положительных образцов в тесте ALEX составило три для Par j 2 и Cor a 14, что привело к самой низкой положительной согласованности в этом исследовании, 13% и 23%, соответственно. Из оставшихся проанализированных двадцати одного компонента для двух компонентов показана высокая согласованность результатов тестов ALEX и ImmunoCAP на специфический IgE и для двух – низкая (Рис. 4). В случае тестов ImmunoCAP результаты выше порогового уровня теста ALEX, т. е., ≥0.3 kUA /L, считались положительными. Опять же, количество положительных результатов в тестах ImmunoCAP могло бы быть выше в случае включения результатов от 0,1 kUA /L (отражая LoQ тестов ImmunoCAP на специфический IgE).

Выводы:

  • Чувствительность компонентных тестов ALEX ниже чувствительности тестов ImmunoCAP на компоненты аллергенов: тест ALEX даёт 33% (140/426) ложноотрицательных результатов по сравнению с результатами тестов ImmunoCAP на sIgE.

​

  • Тест ALEX имеет меньший динамический диапазон: ни один результат не был выше 38 kUA/L (n=426 положительных точек) в образцах с результатом до 150 kUA/L, согласно тестам ImmunoCAP на специфический IgE.​

​​

​

  • Общая согласованность в рамках класса составила 70%, варьируя в диапазоне 15-66% для разных положительных классов.

​

​

​

  • Тест ALEX не имеет очевидных проблем с фоном: тесты ALEX и ImmunoCAP на специфический IgE продемонстрировали согласованность 98,9% для отрицательных результатов.

2019-09-11_17-46-45.png

Рисунок 4a. Корреляция между результатами тестов ALEX и ImmunoCAP на специфический IgE к аллергокомпонентам в kUA /L для Phl p 5 тимофеевки (вверху) и Der p 1 D. pteronyssinus (внизу). Все данные приведены в виде логарифмической диаграммы разброса данных (рисунки слева). Корреляции точечных данных, положительные для обеих систем и в рамках измерительного диапазона теста ALEX 0.3-50 kUA /L, показаны справа (регрессионная кривая красного цвета). 20 из 44 образцов и 18 из 38 образцов для Phl p 5 and Der p 1, соответственно, были положительны в тестах ImmunoCAP на специфический IgE (≥0.3 kUA /L). В тесте ALEX соответствующие значения для компонентов были 19 и 14, соответственно.

2019-09-11_17-49-17.png

Рисунок 4b. Корреляция между результатами тестов ALEX и ImmunoCAP на специфический IgE к аллергокомпонентам в kUA /L для Jug r 1 лесного ореха (вверху) и Gal d 2 белка куриного яйца (внизу). Корреляции точечных данных, положительные для обеих систем и в рамках измерительного диапазона теста ALEX 0,3-50 kUA /L, показаны справа (регрессионная кривая красного цвета). 19 из 42 образцов и 15 из 19 образцов были положительными в тестах ImmunoCAP sIgE к Jug r 1 иd Gal d 2, соответственно (≥0.3 kUA /L). В тесте ALEX соответствующие значения для компонентов составили 10 для обоих классов.

Анализ отрицательных результатов для экстрактов в тесте ALEX

по сравнению с результатами для компонентов в тестах ALEX и ImmunoCAP на примере лесного ореха

Для 25 из 64 исследованных образцов были получены положительные результаты в тесте ImmunoCAP на полный аллерген лесного ореха, однако в тесте ALEX результаты были отрицательными.
 

Результаты анализа IgE в ответ на компоненты для 24 из этих образцов приведены в Табл. 4. Двадцать три сыворотки давали положительные результаты на любой из компонентов лесного ореха в тестах ImmunoCAP, в то время как в тесте ALEX было получено всего девять положительных результатов в ответ на компоненты лесного
ореха.

​

Эти данные подчёркивают, что отрицательные результаты в тесте ALEX на экстракты не обязательно являются отрицательными на самом деле. Кроме того, они демонстрируют, что ложноотрицательные результаты исследований экстрактов не уравновешиваются
положительными результатами ответа sIgE на компоненты и сенсибилизация к определённым источникам аллергенов может быть полностью упущена.
 

2019-09-12_10-47-50.png

Таблица 4. Сравнение результатов исследования sIgE-ответа на компоненты аллергенов на двух платформах при использовании сыворотки с отрицательным ответом на экстракт лесного ореха в тесте ALEX, но положительным в тестах ImmunoCAP на полные аллергены. Показаны оба порога в 0.1 и 0.3 kUA/L для тестов ImmunoCAP на специфический IgE к компонентам аллергенов.

​

Выводы:

  • Отрицательные результаты для экстрактов аллергенов,
    полученные в тесте ALEX, являются спорными.

  • Очевидный низкий уровень специфического IgE для
    экстракта, как видно из приведенного примера, не компенсируется положительными результатами специфических IgE к компонентам в тесте ALEX.

Количественные сравнения

Важно отметить, что ложноотрицательные показатели (см. табл. 6) не претерпели значительных изменений при анализе только сывороток, не содержащих sIgE к перекрестно-реактивным карбогидратным детерминантам, что определялось в тесте ImmunoCAP на специфический IgE к MUXF3 (o214, CCD) (n=54-56).
 

Возможно, низкая чувствительность теста ALEX хотя бы отчасти является следствием необходимости пятикратного разведения сыворотки согласно протоколу теста ALEX.

​

Пятикратное разведение образцов в тесте ALEX позволяет ингибировать CCD. Согласно информации производителя, снижение CCD-реактивности на 85 % достигается благодаря этому этапу инкубации, а при увеличении времени инкубации до 30 минут CCD-реактивность уменьшается до 95 %.6
 

В случае ImmunoCAP ISAC нет необходимости в разведении сыворотки, и на данный момент в чипе ImmunoCAP ISAC sIgE 112 присутствуют лишь шесть CCD-содержащих компонентов из 112. Когда новый чип ImmunoCAP ISAC E112i будет запущен, в нём останется лишь четыре CCD-содержащих аллерген-компонента.
 

Результаты тестов ALEX и ImmunoCAP ISAC sIgE 112 на компоненты аллергенов

2019-09-12_11-01-41.png

Таблица 5. Согласованность между результатами теста ALEX на компоненты
аллергенов и теста ImmunoCAP ISAC 112 на компоненты аллергенов (согласно «классам ALEX») (вверху). Тепловые карты результатов тестов ALEX и
ImmunoCAP ISAC 112 Components (внизу). Уровень ложноотрицательных
результатов для теста ALEX относительно теста ImmunoCAP ISAC 112
составил 15.8% (59/374), в то время как уровень ложноотрицательных результатов для теста ImmunoCAP ISAC 112 относительно теста ALEX составил
9.5% (33/348).

Для сравнения ALEX и ImmunoCAP ISAC sIgE 112 рассчёт согласованности классов был проведён двумя способами, при условии, что каждая система выдаёт «истинные» результаты. Ложноотрицательные результаты для ALEX относительно теста ImmunoCAP ISAC sIgE 112 были на уровне 15.8% (59/374), в то время, как отрицательные результаты для ImmunoCAP ISAC sIgE 112 относительно теста ALEX составили 9.5% (33/348).

 

В целом, результат согласованности двух систем оказался удовлетворительным. Общая согласованность по классам варьировала в рамках 61-97 % для исследованных компонентов, в подавляющем большинстве составляя свыше 80%. Наименьшая согласованность в классах 1-3 (между 19 и 51 %), вероятнее всего, наблюдалась из-за низкой чувствительности теста ALEX. Согласованность в рамках класса 4, т. е., уровня slgE выше 15 kUA/L, составила 78%.
 

2019-09-12_11-04-16.png

Рисунок 5. Результаты уровня sIgE к компонентам аллергенов в тесте ALEX
не превышают значений выше 39 kUA/L из 407 положительных точек данных,
в то время как тест ImmunoCAP ISAC 112 определяет специфический IgE
приблизительно до 100 ISU-E На графике отсутствуют тринадцать положительных точек данных (сокращены).

Количественные сравнения

Во всех сравнениях была выявлена более низкая чувствительность теста ALEX по сравнению с тестами ImmunoCAP, что отражено в уровне ложноторицательных результатов для теста ALEX (Таблица 6).
 

2019-09-12_11-09-58.png

Таблица 6. Общая чувствительность теста ALEX

Тесты ALEX® tIgEнизкий
динамический диапазон и слабую согласованность с количественными результатами
однокомпонентных тестов ImmunoCAP

Заключение

  • Тесты ALEX® tIgE, slgE к полным аллергенам и компонентам аллергенов показывают низкий динамический диапазон и слабую согласованность с количественными результатами однокомпонентных тестов ImmunoCAP.

​

  • Чувствительность теста ALEX во всех сравнениях ниже, чем у платформ ImmunoCAP.
    Наличие фонового шума не обнаружено.

​

  • В сравнении с чипом ImmunoCAP ISAC sIgE 112 согласованность выше, но чувствительность и динамический диапазон всё равно на низком уровне.

     

Источники

  1.  ALEX - Allergy explorer. The smart way to explore allergy. Доступно на www.macroarraydx.com

  2. ImmunoCAP total IgE Direction for Use 52- 5292 - EN/08, доступно на https://dfu.phadia.com/Data/Pdf/5be5621c89c2320848d710f6.pdf

  3. ImmunoCAP Specific IgE Direction for Use 52 -5291 -EN/09, доступно на https://dfu.phadia.com/Data/Pdf/5be441b889c2320848d6fb28.pdf

  4. ImmunoCAP ISAC sIgE 112 Directions for Use 81 - 0002 - 62/02.                                                                            Доступно на www.thermofisher.com

  5. Ekaterina Manuilova, Andre Schuetzenmeister, Fabian Model (2014). mcr: Method Comparison Regression. R package version 1.2.1.                                                                                                                                                                                Available at https://CRAN.R - project.org/package=mcr 3

  6. ALEX - Allergy Explorer Instruction for Use. Доступно на at www.macroarraydx.com

 

Полный набор данных доступен во внутренних отчётах Thermo Fisher Scientific:

  • ID677873 результаты сравнения ImmunoCAP и ALEX

  • ID666201 результаты сравнения ISAC и ALEX

Список продуктов ImmunoCAP

ImmunoCAP ISAC sIgE 112
ImmunoCAP Allergen d1, House dust mite
ImmunoCAP Allergen d2, House dust mite
ImmunoCAP Allergen d202, Allergen component rDer p 1, House dust mite
ImmunoCAP Allergen d203, Allergen component rDer p 2, House dust mite
ImmunoCAP Allergen d205, Allergen component rDer p 10 Tropomyosin, House dust mite
ImmunoCAP Allergen d209, Allergen component rDer p 23, House dust mite
ImmunoCAP Allergen f4, Wheat
ImmunoCAP Allergen f98, Gliadin
ImmunoCAP Allergen f95, Peach
ImmunoCAP Allergen f420, Allergen component rPru p 3 LTP, Peach
ImmunoCAP Allergen t9, Olive
ImmunoCAP Allergen t224, Allergen component rOle e 1, Olive
ImmunoCAP Allergen g6, Timothy
ImmunoCAP Allergen g205, Allergen component rPhl p 1 Timothy
ImmunoCAP Allergen g206, Allergen component rPhl p 2 Timothy
ImmunoCAP Allergen g215, Allergen component rPhl p 5b Timothy
ImmunoCAP Allergen g209, Allergen component rPhl p 6 Timothy
ImmunoCAP Allergen g210 Allergen component rPhl p 7 Timothy

ImmunoCAP Allergen g212 Allergen component rPhl p 12 Profilin, Timothy
ImmunoCAP Allergen w21, Wall pellitory
ImmunoCAP Allergen w211, Allergen component rParj 2 LTP, Wall pellitory
ImmunoCAP Allergen f1, Egg white
ImmunoCAP Allergen f233, Allergen component nGal d 1 Ovomucoid, Egg
ImmunoCAP Allergen f232, Allergen component nGal d 2 Ovalbumin, Egg
ImmunoCAP Allergen f323, Allergen component nGal d 3 Conalbumin, Egg
ImmunoCAP Allergen f2, Milk
ImmunoCAP Allergen f76, Allergen component nBos d 4 Alpha-lactalbumin, Milk
ImmunoCAP Allergen f77, Allergen component nBos d 5 Beta -lactoglobulin, Milk
ImmunoCAP Allergen f78, Allergen component nBos d 8 Casein, Milk
ImmunoCAP Allergen f17, Hazel nut
ImmunoCAP Allergen f428, Allergen component rCora 1 PR - 10, Hazel nut
ImmunoCAP Allergen f425, Allergen component rCora 8, Hazel nut
ImmunoCAP Allergen f440, Allergen component nCora 9, Hazelnut
ImmunoCAP Allergen f439, Allergen component rCora 14, Hazelnut
ImmunoCAP Allergen f256, Walnut
ImmunoCAP Allergen f441, Allergen component rJug r 1, Walnut
ImmunoCAP Allergen o214, Allergen component MUXF3CCD, Bromelain
 

© 2019 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. ALEX is a trademark of Macro Array Diagnostics.
All other trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries. Legal Manufacturer: Phadia AB, Uppsala, Sweden

bottom of page